摘要：由于傳統方法在檢測水中大腸菌群和大腸埃希氏菌需要48小時左右,且操作過程復雜,難以掌握。現介紹一種快速簡便的檢測方法，根據生活飲用水衛生標準（GB/T 5750-2006）中推薦的固定底物技術酶底物法可購買到市售化產品西安海研生物科技有限公司的Colitech試劑。用于檢測100ml水樣，只需手工操作2分鐘，即可在24小時內同時定量檢測出大腸菌群和大腸埃希氏菌。此方法大大的減少了工作量，避免了使用多管法的逐級稀釋帶來的操作誤差；也避免了使用濾膜法時肉眼讀數的人為誤差，所以其假陽性率和假陰性率都比傳統方法低。由于24小時內就得到結果，可以很好的用于突發事件應急。

1. 背景：

目前我國對生活飲用水、水源水、地表水等進行衛生學評價，檢測的指標為大腸菌群和大腸埃希氏菌或糞大腸菌群（耐熱大腸菌群），以這些指標作為糞便污染的指示菌。采用的標準檢測方法為膜過濾法和多管發酵法。但這兩種方法檢測時間相對較長，需48—72小時，需驗證試驗，試驗步驟較為繁瑣，所以不能對水的衛生學狀況做出快速評價。因此，采用快速簡便的檢測方法很必要。固定地物技術酶底物法可以較好的彌補傳統方法的不足。

主要內容：

1、實驗原理

2、儀器設備與試劑耗材

3、實驗步驟

4、討論與分析

2. 原理：

固定底物技術酶底物法（Defined Substrate Technology）采用大腸菌群細菌能產生β-半乳糖苷酶（β-D-galactosidase）分解ONPG（Ortho-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside）使培養液呈黃色，以及大腸埃希氏菌產生β-葡萄糖醛酸酶（β-glucuronidase）分解MUG（4-methyl-umbelliferyl-β-D-glucuronide）使培養液在波長366nm紫外光下產生熒光的原理，來判斷水樣中是否含有大腸菌群及大腸埃希氏菌。固定底物技術酶底物法可以選用國標中推薦粉狀培養基（西安立科公司的酶底物試劑）來進行簡便的操作；無需確認試驗；固定底物技術酶底物法檢測時間短，只需24小時即可同時定量出水樣中大腸菌群和大腸埃希氏菌的MPN值。

3. 試劑和設備：

3.1 試劑：采用固定底物技術酶底物法市售化的MMO-MUG（Minimum Media ONPG-MUG）培養基—酶底物試劑。

3.2 耗材：取樣瓶或使用滅菌的玻璃；51孔定量盤或97孔定量盤。

注：51孔定量盤可在無需稀釋的情況下檢測1—200個目標菌/100ml水樣；97孔定量盤可在無需稀釋的情況下檢測1—2419個目標菌/100ml水樣。

3.3 設備：定量程控封口機；366nm紫外燈；陽性對照物 。

注：海研sea plus定量程控封口機除了將定量盤進行封口外還對100ml水樣平均分配到51個孔或者是97個孔中。

4. 操作方法：

4.1 定性檢測：

4.1.1 適用范圍：

一般用于檢測飲用水、瓶裝水等；這些水樣的結果是不得檢出。所以只需用定性檢測就可滿足試驗要求。

4.1.2 操作步驟：

1) 將一個酶底物試劑倒入裝有100ml水樣的無菌取樣瓶或無菌玻璃瓶中，混勻。

2) 放在36±1℃培養箱，培養24小時；

注：如檢測耐熱大腸菌群（糞大腸菌群）則需放在44.5℃，培養24小時；如果培養時間超過28小時，則陰性結果則結果有效，如果為陽性結果則結果無效，需重做此水樣。

3) 根據下面的結果解釋讀取結果

4) 無需確認試驗

4.2 定量檢測

4.2.1 適用范圍：適用于任何一種水體。

4.2.2 操作步驟：

1) 將一個酶底物試劑倒入裝有100ml水樣的無菌取樣瓶或無菌玻璃瓶中，混勻。

2) 將瓶內的水樣全部倒入51孔或者是97孔定量盤中，以手撫平定量盤背面以趕除孔穴內氣泡，然后使用定量程控封口機進行封口。

3) 將定量盤放在36±1℃培養箱，培養24小時 。

注：如檢測耐熱大腸菌群（糞大腸菌群）則需放在44.5℃，培養24小時；如果培養時間超過28小時，則陰性結果則結果有效，如果為陽性結果則結果無效，需重做此水樣。

4) 根據下面的結果解釋讀取結果。數出陽性格子數后對照MPN表得到結果。

5) 無需確認試驗

5. 測量范圍

5.1 最低檢出限酶底物試劑可以在24小時同時檢測出總大腸菌群和大腸埃希氏菌或耐熱大腸菌群（糞大腸菌群），它可以在100ml水樣中抑制2百萬個雜菌干擾，最低檢出限為每100ml水樣可檢測出1cfu的總大腸菌群，大腸埃希氏菌，耐熱大腸菌群（糞大腸菌群）。

5.2 選用51孔定量盤

在不稀釋的情況下，100ml水樣可檢測200個總大腸菌群，大腸埃希氏菌，耐熱大腸菌群（糞大腸菌群）。

5.3 選用97孔定量盤

在不稀釋的情況下，100ml水樣可檢測2419個總大腸菌群，大腸埃希氏菌，耐熱大腸菌群（糞大腸菌群）。

6 檢測水樣的范圍

飲用水 、源水 、瓶裝水 、中水 、二次供水 、管網水 、廢水 、食品水 、畜牧用水 、醫療用水

7．實驗過程中需注意的地方

如果樣品有背景顏色，請做一個空白實驗，與結果相比較，如果樣品被稀釋，則在讀取MPN表時乘以相應的稀釋倍數，只可使用純水，不含緩沖的水，不含氧化劑的水進行樣品稀釋，如果樣品中含有過多的氯，則在加入試劑時會顯藍光，此時樣品應被終止檢測。

8．結論

總大腸菌群細菌主要由以下4個菌屬細菌組成：埃希氏菌屬、檸檬酸菌屬、克雷伯菌屬和腸桿菌屬。這些菌屬可以在人、畜糞便中檢出，有的也可以在營養豐富的水體中檢出，即非糞便污染的情況下，也有檢出這些細菌的可能性。糞大腸菌群組成與總大腸菌群組成相同，但主要組成是埃希菌屬，在此菌屬中與人類生活密切相關的僅有一個種，即大腸埃希氏菌；檸檬酸菌屬、克雷伯菌屬和腸桿菌屬所占數量較少。作為糞便污染的指示菌，大腸埃希氏菌檢出的意義很大，其次是糞大腸菌群，總大腸菌群的檢出意義略差一些， 固定底物技術酶底物法操作簡便，檢測時間短，可在24小時內同時檢測水中大腸菌群和大腸埃希氏菌的污染狀況且無需確認試驗；減少了傳統方法中人為操作的誤差，能夠更準地判斷水樣的微生物污染狀況；作為飲用水衛生標準的新方法，不但可以用于水樣的例行檢測，更可作為應急突發事件的必備試劑。